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<855> 散射光濁度法和透射光比濁法

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<855> 散射光濁度法和透射光比濁法

 

1.     介紹

散射光濁度法和透射光比濁法是基于光散射現(xiàn)象原理的分析技術(shù)。光散射是一種物理現(xiàn)象,其中光束由于與足夠小的物質(zhì)粒子相互作用而改變其傳播方向(稱為偏轉(zhuǎn))。根據(jù)麥克斯韋電磁理論,散射發(fā)生的先決條件是懸浮顆粒的折射率必須不同于懸浮液體的折射率。差異越大,散射越強(qiáng)烈。光散射有兩種類型:1)彈性散射,其中散射光和入射光的波長(zhǎng)相同;2)非彈性光散射,其中散射光和入射光的波長(zhǎng)不同。只有第一種光散射(彈性)與散射光濁度法和透射光比濁法有關(guān)。

在透射光比濁法中,測(cè)量透射光的強(qiáng)度,并在入射光方向(即0°)測(cè)量散射導(dǎo)致的入射光強(qiáng)度的衰減,并與入射光強(qiáng)度進(jìn)行比較(空白測(cè)量)。被測(cè)特性是懸浮顆粒散射效應(yīng)的間接測(cè)量,稱為濁度。懸浮樣品對(duì)光的任何吸收都會(huì)導(dǎo)致光強(qiáng)度的額外衰減(參見(jiàn)<857> Ultraviolet-Visible Spectroscopy<1857> Ultraviolet-Visible Spectroscopy—Theory and Practice)。因此,確保被測(cè)材料不會(huì)吸收測(cè)量波長(zhǎng)處的光非常重要。實(shí)際上,控制吸收和濁度測(cè)定的方程式是相同的(盡管衰減常數(shù)的值不同)。在散射光濁度法中,測(cè)量與入射光傳播方向成90°角的散射光強(qiáng)度。因此,散射光濁度法濁度測(cè)量是對(duì)懸浮物散射效應(yīng)的直接測(cè)量。

 

2. 術(shù)語(yǔ)和定義

描述濁度法和濁度法的常用術(shù)語(yǔ)包括:

濁度(符號(hào)S):由于懸浮顆粒的光散射效應(yīng),透射入射光束強(qiáng)度降低的一種度量。懸浮物的量可以通過(guò)觀察透射光(比濁法)或散射光(濁度法)來(lái)測(cè)量。

log I0/It = kbc = T

I0=入射光強(qiáng)度

It=透射光強(qiáng)度

k=摩爾濁度系數(shù)

b=樣品池路徑長(zhǎng)度

c=濃度

T=濁度

濁度(符號(hào),τ):在透射光濁度測(cè)量中,濁度是給定懸浮液的入射光束強(qiáng)度/單位長(zhǎng)度減少的量度。國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化組織將濁度定義為“由于存在未溶解物質(zhì)而導(dǎo)致液體透明度降低"。

濁度測(cè)量單位:渾濁度單位用一個(gè)描述符表示,該描述符指示測(cè)量方法。

散射光濁度計(jì)濁度單位(NTU):當(dāng)使用散射光濁度法測(cè)量濁度時(shí),濁度計(jì)以與入射光傳播方向成90°角的角度測(cè)量散射光,濁度單位稱為散射光濁度法濁度單位(NTU)。NTU的大小是根據(jù)初級(jí)福爾馬肼標(biāo)準(zhǔn)品(一種將硫酸肼和六亞甲基四胺溶液混合在水中制成的懸浮液)產(chǎn)生的濁度定義的。更安全的聚合物微珠懸浮液現(xiàn)已上市,并被*為可接受的替代品。然而,所有這些標(biāo)準(zhǔn)都可以追溯到福爾馬肼。初級(jí)福爾馬肼標(biāo)準(zhǔn)溶液的濁度為4000 NTU。

其他*的濁度單位包括福爾馬肼比濁法單位(FTU)和福爾馬肼濁度法單位(FNU)。這些單位相當(dāng)于0-40 NTU范圍內(nèi)的NTU。

 

3.     應(yīng)用

透射光比濁法和散射光濁度法技術(shù)的應(yīng)用包括1)溶液和/或懸浮液的濃度測(cè)定(通過(guò)在控制良好的反應(yīng)參數(shù)下沉淀和懸浮產(chǎn)生的沉淀物,來(lái)測(cè)定幾種陽(yáng)離子和陰離子);2)測(cè)量混濁溶液或懸浮液的濁度;3)測(cè)定分子量在1000到數(shù)億之間的多分散體系的重均分子量和尺寸;4)測(cè)量免疫分析的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)或免疫沉淀動(dòng)力學(xué)(比率散射濁度法);5)監(jiān)測(cè)細(xì)胞和細(xì)菌的生長(zhǎng);6)懸浮物粒度分布測(cè)定、顆粒計(jì)數(shù)等。

比率散射濁度法廣泛用于疫苗成分分析和/或血清成分的定量。它還用于重組生物制藥中的宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)鑒定。當(dāng)使用該技術(shù)時(shí),通過(guò)測(cè)量抗原-抗血清或抗原純化抗體復(fù)合物的光散射反應(yīng)的變化,來(lái)計(jì)算導(dǎo)致免疫抗體-抗原沉淀反應(yīng)或凝集反應(yīng)的抗原(Ag)或抗體(Ab)的量。通??紤]抗原共價(jià)連接或吸附在聚合物微球上,以提高散射效率;由此產(chǎn)生的技術(shù)被稱為顆粒增強(qiáng)免疫分析"。雖然這項(xiàng)技術(shù)被稱為散射光濁度法,但通常散射光和透射光都是用比率儀器測(cè)量的。

散射光法濁度測(cè)量在低濁度范圍(散射介質(zhì)濃度相對(duì)較低)更可靠。在該范圍內(nèi),觀察到樣品濃度與檢測(cè)器信號(hào)強(qiáng)度(以NTU表示)之間存在線性關(guān)系。隨著濃度的增加,多次散射的入射角也會(huì)增加,從而偏離線性響應(yīng)。支持可靠線性關(guān)系的最大NTU值在1750–2000 NTU范圍內(nèi)。透射光比濁法適用于更高的濁度范圍(散射介質(zhì)的濃度)。為了獲得一致的結(jié)果,必須仔細(xì)控制所有測(cè)量變量。在可能的情況下,可以測(cè)量極稀的懸浮液。

 

4. 儀器儀表

用于透射光比濁法和散射光濁度法測(cè)量的儀器分別稱為透射光濁度計(jì)和散射光濁度計(jì)。通常,這些儀器包括一個(gè)帶有濾光器的汞燈(用于強(qiáng)綠線或藍(lán)線)、一個(gè)快門、一組具有已知透射率的中性濾光器和一個(gè)靈敏的光電倍增管,該光電倍增管可安裝在與入射光傳播方向成90°角的位置,或者在一個(gè)臂上,它可以圍繞溶液?jiǎn)卧D(zhuǎn),并通過(guò)不透光外殼外的表盤設(shè)置為?135°+135°的任何角度。溶液池的形狀多種多樣,例如用于測(cè)量90°散射的正方形;45°、90°135°散射為半八角形;圓柱形可適用于所有角度的散射(見(jiàn)圖1)。

1.代表性濁度儀。注意,探測(cè)器2可安裝在可移動(dòng)臂上。

濁度也可以用標(biāo)準(zhǔn)光電濾光光度計(jì)或分光光度計(jì)測(cè)量,最好是在光譜的藍(lán)色部分進(jìn)行照明。散射光濁度法測(cè)量需要一個(gè)裝有光電管的儀器,以便接收散射光,而不是透射光。由于這與熒光計(jì)中使用的幾何結(jié)構(gòu)相同,因此可通過(guò)適當(dāng)選擇濾光片將其用作濁度計(jì)。比率濁度計(jì)結(jié)合了90°散射光濁度法和透射光比濁法。它包含光電管,接收和測(cè)量與樣品成90°角的散射光,以及接收和測(cè)量樣品前面的前向散射光。它還測(cè)量直接穿過(guò)樣品的光。通過(guò)90°角散射光測(cè)量值,前向散射光測(cè)量值和透射光測(cè)量值之和,計(jì)算兩者的比值,可獲得線性度。使用比率濁度測(cè)量系統(tǒng)的好處是雜散光的測(cè)量變得可以忽略不計(jì)。此外,彩色懸浮液的濁度測(cè)定僅使用透射光比濁法濁度儀或濁度儀(帶比率模式)進(jìn)行,因?yàn)樵摮绦蜓a(bǔ)償了懸浮液顏色導(dǎo)致的光衰減。通常,這些儀器中的光源是鎢燈,在2700 K的燈絲溫度下工作,大部分光強(qiáng)約為550 nm。也可使用其他合適的光源。通常,探測(cè)器是硅二極管和光電倍增管。另一種消除顏色效應(yīng)的方法是使用紅外發(fā)光二極管作為光源,其最大發(fā)射中心約為860 nm,光譜帶寬為60 nm。當(dāng)激光光源也被使用時(shí),尤其是在濁度測(cè)量?jī)x器中,這種技術(shù)通常被稱為激光濁度測(cè)量"。使用激光散射光濁度計(jì)的優(yōu)點(diǎn)是,在非常低的檢測(cè)水平下,信噪比顯著提高。通常光源是工作波長(zhǎng)為660 nm的激光二極管。激光束的高功率密度使較小粒子產(chǎn)生更高的散射強(qiáng)度。與吸收未散射光的光阱相結(jié)合,該系統(tǒng)可顯著降低雜散光。當(dāng)專著中的某個(gè)程序指示使用散射光濁度計(jì)或透射光濁度計(jì)時(shí),可以使用在比率模式下工作的儀器。

 

5. 福爾馬肼濁度標(biāo)準(zhǔn)

福爾馬肼是目前已知的主要濁度標(biāo)準(zhǔn)。所有其他標(biāo)準(zhǔn)都是次要的,必須追溯到福爾馬肼。 主要標(biāo)準(zhǔn)在▲IUPAC Compendium of Chemical Terminology▲(ERR 1-May-2019)第 2 版(金書(shū))中被定義為由用戶使用明確定義的方法和條件從可追溯的材料準(zhǔn)備的標(biāo)準(zhǔn)。

福爾馬肼懸浮液有許多特點(diǎn),以確保其適合作為主要標(biāo)準(zhǔn)。它可以從試劑級(jí)的起始材料中始終如一、準(zhǔn)確地制備。該懸浮液由不同長(zhǎng)度和隨機(jī)構(gòu)型的聚合物組成,其組成的聚合物的形狀和尺寸從小于0.1 μm到大于10 μm不等。盡管聚合物鏈長(zhǎng)分布已被證明因制備而異,但總的濁度結(jié)果是可以很好地重現(xiàn)的。

 

5.1 Preparation of the Formazin Standards 福爾馬肼標(biāo)準(zhǔn)液的制備

硫酸肼溶液1.000 g ACS級(jí)硫酸肼(N2H4·H2SO4)溶解在100 mL A類容量瓶中中,并用無(wú)顆粒水稀釋至刻度。讓該溶液靜置4-6小時(shí)。

初級(jí)福爾馬肼標(biāo)準(zhǔn)液:2.50 g分析級(jí)六亞甲基四胺[(CH2)6N4]溶于25.0 mL無(wú)顆粒水中,裝入100 mL燒瓶。使用A25 mL移液管加入25.0 mL硫酸肼溶液,并充分混合。使用前,讓制劑在25±1°的溫度下靜置48小時(shí)。由此產(chǎn)生的懸浮液可穩(wěn)定運(yùn)行2個(gè)月。

福爾馬肼儲(chǔ)備標(biāo)準(zhǔn)懸浮液1使用15 mL A類移液管,將15 mL福爾馬肼初級(jí)標(biāo)準(zhǔn)液轉(zhuǎn)移至1 L容量瓶中,并用無(wú)顆粒水稀釋至刻度并混合。所得懸浮液的濁度為60 NTU。

福爾馬肼儲(chǔ)備標(biāo)準(zhǔn)懸浮液2使用50 mL A類移液管,將50 mL福爾馬肼初級(jí)標(biāo)準(zhǔn)液轉(zhuǎn)移至200 mL容量瓶中,并用無(wú)顆粒水稀釋至刻度并混合。所得懸浮液的濁度為1000 NTU。

福爾馬肼參考懸浮液:根據(jù)表1,在100 mL容量瓶中混合各份福爾馬肼儲(chǔ)備標(biāo)準(zhǔn)懸浮液和無(wú)顆粒水,制備福爾馬肼參考懸浮液。




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